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    急性早幼粒細胞白血病實驗室診斷

    時間:2019/6/27欄目:藥學論文

    急性早幼粒細胞白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)是急性髓細胞白血病(acutemyeloblasticleukemia,AML)的M3亞型[1],多伴有異常染色體t(15;17)而形成PML-RARα融合基因。以異常早幼粒細胞增生為主,臨床上除有發熱、感染、貧血和浸潤等急性白血病的癥狀外,廣泛而嚴重的出血常是本病的特點,易并發彌散性血管內凝血(DIC),可發生原發性纖溶亢進。經誘導化療或骨髓移植后達到臨床完全緩解(CR),但體內依然會殘存約106~108個微量白血病細胞(MRLC),即微量殘留白血病(minimalresiduaidisease,MRD)[2],而這些細胞則是APL復發的根源。近年來,隨著分子生物學技術的迅猛發展,通過聯合測定PML-RARα融合基因進行診斷,即將形態學(morphology,M)、免疫學(immunology,I)、細胞遺傳學(cytogenetics,C)和分子生物學(molecu-lar,M)相聯合的MICM分型技術[3],極大地提高了APL診斷的準確率,并為MRD提供了更為可靠的診斷依據。本文結合近幾年相關學者利用MICM分型技術和D-二聚體檢測等在APL上的診斷報道及相應研究成果,對這些診斷方法進行綜述,并探討各診斷方法的優劣。

    急性早幼粒細胞白血病實驗室診斷

     

    1血細胞形態學在診斷中的應用

    1.1血象APL的血涂片觀察,可見血紅蛋白和紅細胞呈不同程度的減少;血小板中度到重度減少,多數為(10~30)×109/L。白細胞計數大多病例在15×109/L以下,明顯減少者見于全血細胞減少,但也可有明顯增高(M3v型),分類以異常早幼粒細胞為主,也可見少數原粒及其他階段粒細胞,胞漿易見Auer小體。

    1.2骨髓象多數APL病例骨髓增生極度活躍,個別病例增生低下。各階段幼紅細胞和巨核細胞明顯減少,細胞形態分類以早幼粒細胞為主,占30%~90%(NEC),可見少量的原粒和中幼粒細胞。增多的早幼粒細胞形態異常,大小不一,外形呈橢圓形或不規則形。胞核扭曲變形,可見雙核,核染色質疏松有明顯核仁。胞質中含多量大小不等的嗜苯胺藍顆粒[4],根據胞質中顆粒的不同可分為3個亞型:粗顆粒型(M3a),顆粒粗大深染密集;細顆粒型(M3b),顆粒密集而細小;變異型(M3v),顆粒極少甚至沒有。

    1.3細胞化學染色過氧化物酶(POX)、蘇丹黑染色(SBB)、酸性磷酸酶(ACP)、非特異性脂酶(NSE)均呈陽性或強陽性;且非特異性脂酶(NSE)不被NaF抑制,中性粒細胞堿性磷酸酶(NAP)積分減低。通過APL細胞的形態學特征而對其進行分型主要依據1976年法(F)、美(A)、英(B)三國協作組提出的急性白血病FAB形態學分型方案及診斷標準(1985年有修改)[5]。借助光學顯微鏡和一定的細胞化學染色技術,在形態學上對APL做出初步的分型診斷。由于僅是憑借人眼進行分型,其在細胞形態的辨認上易受檢驗人員學識水平、工作經驗等因素影響,從而影響對APL分型的準確性;且靈敏度低,對于MRD的監測也很難實施。近幾十年,國際上在白血病FAB分型的基礎上又開展了免疫學、細胞遺傳學和分子生物學技術的研究工作,大大提高了對白血病診斷的準確性也更利于對MRD的監測[6]。但利用光學顯微鏡的形態學診斷也一直被臨床沿用,主要由于光學顯微鏡方便易得,成本相對較低,利于普及,特別是基層醫院,可以作為白血病篩查的主要手段;且對于細胞形態典型的病例,血細胞形態學診斷更是有利于疾病的及時診斷和治療。

    2免疫學分型在診斷中的應用

    典型的APL免疫學表型呈CD13、CD33陽性,CD34及HLA-DR陰性,CD34陽性的APL惡性細胞顆粒小而少,且易出現白細胞計數增高,預后較差[7]。近年來隨著單克隆抗體的不斷開發及流式細胞術的廣泛開展,急性白血病免疫表型研究得到迅猛發展,極大地提高了APL診斷和分型的準確性[8]。同時隨著流式細胞儀(FCM)性能的不斷完善,也使得MRD的檢測更為靈敏。FCM是將單克隆抗體、流體力學、免疫熒光、計算機等技術相結合,測量射門參數在單細胞水平上辨認細胞形態、大小和熒光等特征,其檢測快速、簡便,特異性好、敏感度高,能對大量細胞進行定量分析,使用的單克隆抗體容易購買,價格相對便宜,便于臨床推廣。但由于目前缺乏理想的抗體組合,FCM檢測APL患者MRD的靈敏度還較低[9];且隨著病程發展,細胞表面的抗原發生改變,亦會導致結果假陰性。因此,較多研究中心建議同時采用多種不同的免疫表型會使這種影響降至最低[10]。張紅靈等[11]人采用一組四色熒光標記單克隆抗體組合(CD15-CD11b-CD33-CD45)的流式細胞儀對40例初診時經形態學及流式免疫分型診斷為APL的白血病患者及其治療后12例骨髓標本進行檢測,同時檢測正常對照8例。以CD45/SSC選定粒細胞門,選出其中CD33+細胞再進一步分析CD11b及CD15的表達。結果發現CD33+APL白血病細胞群均表達CD15-CD11b-CD33+,有少數病例同時含有少量CD15-CD11b+CD33+分化細胞。而在正常骨髓標本中以CD45/SSC設門粒細胞群CD15-CD11b-CD33+細胞多數為0,以CD15++CD11b++細胞為主,少數表達CD15+CD11b++,CD15+CD11b+,CD15++CD11b+和CD15++CD11b-細胞,表現出與白血病早幼粒細胞明顯不同的表型。因此四色組合FCM可用于APL中MRD的檢測。

    3細胞遺傳學在診斷中的應用

    約70%~90%的APL具有特異染色體t(15;17)易位,形成PML-RARα融合基因,這是APL特有的細胞遺傳學標志[12]。PML-RARα產物可抑制RARα-RXR二聚體,進而使早幼粒細胞分化成熟障礙[13]。臨床上全反式維甲酸ATRT誘導分化治療能使85%左右的APL患者獲得緩解,預后較好;極少數無此融合基因者,維甲酸治療不敏感,預后較差。常規細胞遺傳學中的染色體檢驗主要包括染色體顯帶/非顯帶技術、染色體高分辨技術和染色體脆性部位顯示技術等。侯繼申等人[14]研究表明APL的細胞遺傳學與形態學的相關性并不總是一致的。少數具變異易位核型、變異型APL患者常表現不典型的形態學特征,易誤診為其他白血病。其研究的39例APL患者中有2例APL初診時被誤診為M2和M5,其中1例早幼粒細胞胞質內富含多個空泡、顆粒稀少,可能與早幼粒細胞顆粒缺失導致空泡形成有關,經核型分析確診。因此常規染色體核型分析在形態不典型的APL診斷中具有重要作用,可提高APL診斷的準確性和靈敏度。常規染色體核型分析作為經典的分析細胞遺傳學方法,已研究的較為成熟,由于著眼于所有染色體因此容易發現新的染色體異常,其主要不足是對于標本質量要求較高,靈敏度較低,容易出現假陰性結果,且對于導致白血病復發的微小殘留病監測較不敏感[15]。

    4分子生物學檢驗在診斷中的應用

    4.1熒光原位雜交技術熒光原位雜交技術(FISH)是一種高分辨率和高靈敏度的染色體和基因分析技術[16],通過將生物素標記的DNA探針與互補的DNA鏈染色體原位雜交,熒光顯色后顯微鏡觀察,其將細胞遺傳學和分子生物學檢測技術充分結合,不僅用于分裂中期細胞,還可用于細胞分裂間期,拓展了檢測范圍,提高了白血病診斷和MRD檢測的靈敏度[17]。鄭玲等人[18]利用多重熒光原位雜交(M-FISH)技術對20例APL患者進行檢測,并與常規細胞遺傳學和逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)結果相比較,從而揭示了M-FISH對于APL的診斷及其MRD的檢測有重要應用價值:M-FISH雖不如RT-PCR敏感,但其反映的是處于增殖期的單個白血病細胞的狀況,通過反復檢測可以動態地觀察體內白血病細胞負荷的消長,似比RT-PCR更能預測白血病的復發。同時GordonDewaldW[19]在其報道中表明FISH還可以檢測一些變異型的RARα融合基因,且檢測效率高,利于標準化開展。

    4.2聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應(PCR)是一種用于體外擴增核酸片段的技術[20],在進行APL檢測時目前臨床常用的是逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)以及在PCR反應體系中加入了熒光基團的實時熒光定量PCR(RQ-PCR)[21]。趙威等人[22]利用實時定量PT-PCR技術可檢測出10-5μg人急性早幼粒細胞白血病細胞株(NB4)細胞cDNA中的PML-RARα融合基因,其靈敏度高、重復性好,且有助于監測白血病微小殘留病灶。實時定量RT-PCR是在普通PCR反應中加入能與PCR產物結合的熒光探針或熒光染料,使之熒光信號隨著擴增產物的增加而成比例增長,儀器實時檢測每一個循環結束后的熒光強度,通過與標準曲線對比得出定量結果[23],動態監測PML-RARα融合基因,以及PML-RARα亞型[24],來檢測APL細胞的殘余數量和預測復發,還可以預測白血病患者的治療反應,從而成為指導臨床個體化治療、預防復發和提高患者生存率的重要手段。

    5D-二聚體檢測在APL中的臨床價值

    近年來,D-二聚體在幫助診斷凝血系統和纖溶亢進,特別是繼發性纖溶亢進等方面的臨床價值越來越受到醫學專家的重視[25]。急性早幼粒細胞白血病(APL)在疾病進程和治療期最常見的臨床表現是廣泛而嚴重的出血[26],甚至出現顱內出血,且易并發彌散性血管內凝血(DIC),從而繼發纖溶亢進。究其原因,有研究表明因為APL的異常早幼粒細胞具有合成釋放大量促凝物質的能力,如組織因子,這些促凝物質會激活凝血系統,引起繼發性的纖溶功能亢進,當這些細胞增多到一定程度時,血液將呈現為高凝狀態,機體內微循環廣泛形成血栓,進一步促進繼發性纖溶亢進,造成嚴重出血等并發癥狀。因而血漿D-二聚體的檢測對APL有一定的診斷意義。董大鵬等人[27]通過臨床上72例APL患者治療前和治療后D-二聚體含量檢測結果分析得出該指標有較高的靈敏度,能夠較好的反應早期患者體內的纖溶亢進及凝血系統激活狀態。通過檢測患者血D-二聚體含量可以直接反映D-二聚體水平和患者病情的變化情況,因此能夠作為APL病情進展及預后的重要參考指標[28],且該指標的檢測在臨床上簡便、快速、成本低,利于普及。但值得注意的是,任何引起DIC的疾病都會導致D-二聚體的增高,因此缺乏特異性,一般只作為APL繼發DIC診斷的實用性指標[29]。

    綜上所述,APL的實驗室診斷方法已不單靠FAB形態學分型,免疫學、細胞遺傳學以及分子生物學的發展,為白血病的診斷,特別是MRD的診斷,提供了更精確,更敏感,更為標準化的檢測技術。這不僅使我們對APL的本質、發病機制和生物學特性有了進一步的了解,而且對指導臨床治療和判斷預后復發更是具有相當大的臨床實用價值。而FCM、FISH、PCR等這些技術的應用雖然大大提高APL診斷敏感性,但由于其對儀器和試劑的要求條件高、成本高,且檢測周期較長,目前在臨床較難完全普及。而針對APL,由于其更易并發DIC,D-二聚體的檢測雖然特異性不強,但在于其成本較低,敏感性較高,也逐漸被臨床所重視。因此在節約成本、減少診斷時間、為患者爭取寶貴的治療時間上,APL的實驗室診斷方法依然還有更廣闊的研究空間[30]。

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